Comparison between cultivation and 16s RNA sequencing based- approaches analysis for bacteria in urine and cerebrospinal fluid.
Date
2022-05-28
Authors
Amal Eissa Khader Abuhilal
امل عيسى خضر ابوهلال
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Al-Quds University
Abstract
.
يعتبر اختيار الطريقة الامثل والاكثر دقة وحساسية في الكشف عن البكتيريا من أهم التحديات في علم الاحياء الدقيقة ، وخصوصا في حالات الطوارئ والامراض المنتشرة والمعدية .
يتم في مختبرات المستشفيات جمع عينات (كالدم وسوائل الجسم) من المرضى وفي هذه الدراسة تم التركيز على عينات البول و عينات سائل النخاع الشوكي ، وتعتبر من اهم العينات التي تساعد في الكشف عن حالة المرضى ،لا سيما عندما تكون الاعراض غير واضحة لدى الاطباء وخاصة عند الاطفال وكبار السن ، لان اغلب الطرق تفشل في تحديد مسبب المرض .
تمثل الاصابة بمرض التهاب السحايا البكتيري ، من الامراض التي تهدد حياة الانسان ويمكن ان تؤدي الى الوفاة او حصول مضاعفات تؤثر على حياة الانسان ، ولذلك يجب اختيار طريقة لتشخيص هذه البكتيريا باسرع وقت وتحديد العلاج المناسب لها.
فحص زراعة البكتيريا يعتبر من الطرق التقليدية للكشف عن البكتيريا ، ويمتلك العديد من التحديات كطريقة جمع العينات ،حجم العينة، الوقت المستهلك لزراعة العينة وظهور النتائج ومقاومة بعض السلالات البكتيرية للمضادات الحيوية بالاضافة الى السلالات التي لا يمكن زراعتها في المختبر.
ان الهدف الرئيس لهذه الدراسة هو ايجاد طرق تشخيصية جديدة ذات دقة وحساسية عالية للكشف عن العدوى البكتيرية في عينات البول وسائل النخاع الشوكي ومقارنتها بالطرق التقليدية.
تم مقارنة طريقة زراعة البكتيريا التقليدية (الكلاسيكية ) مع تقنية( ن جي اس ) والتي تعتمد على الجيل التالي من تحديد الحمض النووي للكشف عن معظم الخلايا البكتيرية في العينات المجموعة.
إن تقنية الجيل القادم من تحديد تسلسل الحمض النووي (NGS) ، هي تقنية جديدة نسبيا تسمح بتحديد شامل لتسلسل الحمض النووي وتمكن من انتاج مجموعة من المعلومات الوراثية من الكائنات الحية بشكل متوازي وتوفر قياسا كميا مفصلا لكل جزء من اجزاء DNA المتسلسلة ، حيث تم استخدام بادئات ترتبط على هذه التسلسلات لزيادة اعداد مقاطع الجينات) ( 16S rRNAلانواع البكتيرية.
تمت هذه الدراسة، بعد جمع 50 عينة بول (30 عينة ايجابية الاصابة بالبكتيريا، 15 عينة لا نمو كبيرعليها و 5 عينة سلبية الاصابة بالبكتيريا) و 14 عينة من سائل النخاع الشوكي)4عينات ايجابية الاصابة بالبكتيريا و 10 عينات سلبية الاصابة بالبكتيريا) من مختبر الأحياء الدقيقة في مستشفى المقاصد - القدس - فلسطين. تم جمع نتائج الزراعة البكتيرية من نفس مختبر مستشفى المقاصد . وقد تم استخراج عينة من الحمض النووي( DNA)في مختبرات جامعة القدس، وبعد ذلك تم تحليل تسلسل الحمض النووي (DNA ) بموائمة احدى الطرق المستخدمة ضمن استراتيجيات شركة Illumina MiSeqلتحليل الحمض النووي DNA . تم إجراء ما مجموعه 64 عينة تم تجميعها وفق الجيل التالي (NGS).
لاحقا تم الحصول على البيانات كملفات FASTQ ثم تم تحويلها الى ملفات FASTA ثم تم تحليلها وفقا للتصنيف البكتيري للجنس والأنواع، حيث يستند الى طول التسلسل .
تمكنا في هذه الدراسة ، اولا : من تحديد أنواع البكتيريا المسببة لالتهاب المسالك البولية لدى الانسان ، الموجودة في عينات البول وأهم الأنواع التي تم تحديدها وهي :
Escherichia coli, Pseudomonas, Klebsiella, Lactobacillus, Enterobacter, streptococcus Group B, Acinetobacter, Staphylococcus, Rickettsia and Gardnerella.
هذه الأنواع موجودة كبكتيريا مسببة للأمراض في المسالك البولية لدى الانسان، والأكثر وفرة وأهمية هي أنواعEscherichia coliالتي تسبب التهاب المسالك البولية، حيث ظهرت هذه البكتيريا في كلا الطريقتين الحديثة والتقليدية.
ثانيا : اهم الانواع التي تم الكشف عنها في عينات سائل النخاع الشوكي (CSF) ، وهي :
Pseudomonas, Enterobacter, Escherichia, Staphylococcus and Lactobacillus.
تعتبرStaphylococcus haemolyticus من اكثر انواع البكتيريا وفرة في عينات سائل النخاع الشوكي التي تم جمعها والتي تتسب بحدوث اللاتهابات في الجهاز العصبي . وايضا ظهرت هذه البكتيريا في كلتا الطريقتين.
وفي الختام ، تعتبر NGSطريقة سريعة وحساسة جدا وطريقة خاصة نستطيع من خلالها الكشف عن انواع البكتيريا التي يصعب كشفها بالطرق التلقليدية : كالبكتيريا بطيئة النمو و الانتهازية و يمكنها الكشف عن خلايا البكتيرية قليلة التركيز في العينات حيث تصل دقتها للكشف عن خلية واحدة في العينة.