Develpoment of PCR systems for detection of Taeniidae family species
Date
2020-06-03
Authors
George Samir Farah Kokaly
جورج سمير فرح كوكالي
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Al-Quds University
جامعة القدس
جامعة القدس
Abstract
Echinococcosis, caused by the larval stage of tapeworms of the genus Echinococcus, is one of the most important zoonotic diseases worldwide. Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis are the most prevalent species infecting humans, resulting in cystic echinococcosis (CE) and alveolar echinococcosis (AE), respectively. In this study we investigated the presence of E. granulosus-specific DNA in dog’s feces by detecting the 18s r-DNA and cytochrome C oxidase I (cox1) mitochondrial gene, beside a repetitive E. granulosus DNA segment.
From the total of seven PCR systems that were designed to amplify E. granulosus DNA that could be found in infected dog fecal samples only three systems were proved to be effective for this purpose. The three PCR systems were adapted first to amplify DNA from other cestode species of Taenidae family to be used in next generation DNA sequence analysis.
The details of the PCR systems were as follow: PCR system 1 and 2 were based on universal primers from 18s rDNA gene, and amplified a DNA segment of 224bp and 216 bp respectively. PCR 3 based on E. granulosus repetitive region and amplified a region of 152 bp. PCR sensitivity test of the three candidate PCR systems was done, the sensitivity limit was 0.0025 ng/ml of E.granulosus genomic DNA.
The three PCR systems were used to detect the presence of E. granulosus in 50 dog fecal samples collected from Yatta town, the produced amplicons were subjected to NGS MiSeq DNA analysis. A bioinformatics workflow was developed through Galaxy/europe online software for identifying E. granulosus specific sequences from thousands of obtained sequences for each sample. PCR system 1 proved to be the most effective and it detected target DNA in 12 from a total of 50 fecal samples (24%). This study will support future research that should reveal a better understanding of the
Echinococcus-host interplay, and suggests new avenues for the identification of
additional targets for diagnosis and chemotherapy.
يعتبر داء المشوكات ، الذي تسببه مرحلة اليرقات من الديدان الشريطية من جنس المكورات، أحد أهم الأمراض الحيوانية في العالم. وتعتبر الطفيليات Echinococcus granulosus و Echinococcus multilocularis هما من أكثر الأنواع انتشارًا من التي تصيب البشر، مما يؤدي إلى داء المشوكات الكيسي ) CE ( والمكورات المتعددت الأكياس ) AE (، على التوالي. في هذه الدراسة ، تحققنا من وجود الحمض النووي الخاص بالطفيلي في براز الكلب من خلال الكشف عن جينات 18s rDNA, COX1 في الميتوكوندريا، إلى جانب شريحة الحمض النووي المتكرر من طفيل E. granulosus . من مجموع ثمانية أنظمة PCR التي تم تصميمها لتضخيم الحمض النووي للطفيل E. granulosus التي يمكن العثور عليها في عينات البراز الكلاب المصابة ثبت أن ثلاثة أنظمة فقط فعالة لهذا الغرض. تم تكييف أنظمة PCR الثلاثة أولاً لتضخيم الحمض النووي أيضا من أنواع أخرى من cestode تنتمي إلى عائلة Taenidae وثانيًا ليتم استخدامها في الجيل التالي من تحليل تسلسل DNA . كانت تفاصيل أنظمة PCR على النحو التالي: اعتمد نظام PCR 1 و 2 على بادئات عامة من جين 81 rDNA وتضخيم جزء DNA من 222 bp و 282 bp على التوالي، و PCR الثالث يعتمد على المنطقة المتكررة للطفيل E. granulosus وتضخيم المنطقة من bp 852 . تم إجراء اختبار حساسية PCR لأنظمة PCR الثلاثة المرشحة، وكان حد الحساسية يصل إلى 0.0025 نانوغرام DNA / مل E.granulosus . تم استخدام أنظمة PCR الثلاثة للكشف عن وجود E. granulosus في 50 عينة من براز الكلاب التي تم جمعها من بلدة يطا، وتم إخضاع القطع المضاعفة لتحليل NGS MiSeq DNA . تم تطوير سير عمل المعلوماتية الحيوية من خلال برنامج Galaxy/europe لتحديد تسلسل E. granulosus المحدد من خلال كشفه من ضمن ألف التسلسلات التي تم الحصول عليها لكل عينة. نظام PCR 1 )% أثبت بأنه الأكثر فاعلية وكشف عن 82 عينة مصابة من إجمالي 50 عينة براز ) 22 خضته لهذا الفحص. نتوقع أن تقوم هذه الدراسة بدعم الأبحاث المستقبلية التي ستكشف عن فهم أفضل للتفاعل بين مضيفات Echinococcus ، وتستخدم كأدوات جديدة لتحديد أهداف إضافية للتشخيص والعلاج الكيميائي.
يعتبر داء المشوكات ، الذي تسببه مرحلة اليرقات من الديدان الشريطية من جنس المكورات، أحد أهم الأمراض الحيوانية في العالم. وتعتبر الطفيليات Echinococcus granulosus و Echinococcus multilocularis هما من أكثر الأنواع انتشارًا من التي تصيب البشر، مما يؤدي إلى داء المشوكات الكيسي ) CE ( والمكورات المتعددت الأكياس ) AE (، على التوالي. في هذه الدراسة ، تحققنا من وجود الحمض النووي الخاص بالطفيلي في براز الكلب من خلال الكشف عن جينات 18s rDNA, COX1 في الميتوكوندريا، إلى جانب شريحة الحمض النووي المتكرر من طفيل E. granulosus . من مجموع ثمانية أنظمة PCR التي تم تصميمها لتضخيم الحمض النووي للطفيل E. granulosus التي يمكن العثور عليها في عينات البراز الكلاب المصابة ثبت أن ثلاثة أنظمة فقط فعالة لهذا الغرض. تم تكييف أنظمة PCR الثلاثة أولاً لتضخيم الحمض النووي أيضا من أنواع أخرى من cestode تنتمي إلى عائلة Taenidae وثانيًا ليتم استخدامها في الجيل التالي من تحليل تسلسل DNA . كانت تفاصيل أنظمة PCR على النحو التالي: اعتمد نظام PCR 1 و 2 على بادئات عامة من جين 81 rDNA وتضخيم جزء DNA من 222 bp و 282 bp على التوالي، و PCR الثالث يعتمد على المنطقة المتكررة للطفيل E. granulosus وتضخيم المنطقة من bp 852 . تم إجراء اختبار حساسية PCR لأنظمة PCR الثلاثة المرشحة، وكان حد الحساسية يصل إلى 0.0025 نانوغرام DNA / مل E.granulosus . تم استخدام أنظمة PCR الثلاثة للكشف عن وجود E. granulosus في 50 عينة من براز الكلاب التي تم جمعها من بلدة يطا، وتم إخضاع القطع المضاعفة لتحليل NGS MiSeq DNA . تم تطوير سير عمل المعلوماتية الحيوية من خلال برنامج Galaxy/europe لتحديد تسلسل E. granulosus المحدد من خلال كشفه من ضمن ألف التسلسلات التي تم الحصول عليها لكل عينة. نظام PCR 1 )% أثبت بأنه الأكثر فاعلية وكشف عن 82 عينة مصابة من إجمالي 50 عينة براز ) 22 خضته لهذا الفحص. نتوقع أن تقوم هذه الدراسة بدعم الأبحاث المستقبلية التي ستكشف عن فهم أفضل للتفاعل بين مضيفات Echinococcus ، وتستخدم كأدوات جديدة لتحديد أهداف إضافية للتشخيص والعلاج الكيميائي.