Characterization of two variants in OSTM1 gene inosteopetrosis-affected Palestinian families.
Date
2025-01-15
Authors
Maram Ali Shawkat Eid
مرام علي عيد
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Al-Quds University
Abstract
Background: Osteopetrosis is a rare genetic disorder characterized by increased bone density and brittle bones. Most cases result from mutations affecting lysosome-related organelle genes. One of the genes associated with osteopetrosis is the OSTM1 gene. Mutations in OSTM1 gene are linked to severe forms of the disease. Whole Exome Sequencing (WES) test was conducted on a group of affected Palestinian families, revealing two new variants c.365T>A (p.Val122Asp) and c.108C>T (p.Gly36Gly) in the OSTM1 gene. To our knowledge, these two variants have not been previously reported as pathogenic. Therefore, the study aims to determine their contribution to osteopetrosis.
Methods: In order to evaluate the pathogenicity of these two genetic variants, whole blood samples were collected from each family member of the inflicted families. DNA and RNA were extracted from each sample. Variant segregation was performed following Sanger sequencing on the obtained samples from the affected volunteers and their extended families’ members. For the c.108 C>T (p.Gly36Gly) variant, which is hypothesized to create a donor splicing site, analysis was undertaken to look for splicing events that could result from the indicated variant. Primers flanking exons one and two were used to determine whether this variant results in abnormal splice variants of the OSTM1 gene.
Results: Segregation of the two variants was assessed by examining their inheritance in 36 participants. The results revealed that unaffected individuals possess both variants either in a heterozygous or wild-type genotype, while affected individuals are homozygous for both variants, indicating a recessive inheritance pattern. RNA analysis of the c.108 C>T (p.Gly36Gly) variant in the OSTM1 gene was also performed. The findings demonstrated that this variant does not affect splicing, contrary to claims made in a 2013 case report by Mahmoud et al., suggesting that the variant might create a donor splice site. This also goes against the predictions made by splicing prediction tools, indicating that the c.108 C>T (p.Gly36Gly) variant could potentially function as a splice site.
Conclusion: This study provided an opportunity to uncover the genetic variant responsible for the disease in the included families. Our results indicate that the variant c.365T>A (p.Val122Asp) segregates well between affected and unaffected family members, however,
c.108C>T (p.Gly36Gly) variant does not affect splicing and thus seems to be a benign or neutral variant. This knowledge can help identify those at risk and provide preventative interventions, improving patient counselling and raising awareness about the importance of premarital screening for the pathogenic variant of the OSTM1 gene.
المقدمة: داء تصلب العظام هو اضطراب وراثي نادر يتميز بزيادة كثافة العظام كما ويسبب هشاشة العظام في الوقت نفسه. تنجم معظم الاصابات عن طفرات تؤثر على العضيات المرتبطة بالعضيات الليزوزومية. يعد جين OSTM1 أحد الجينات المرتبطة بداء تصلب العظم, حدوث طفرات في هذا الجين مرتبطة بشكل وثيق بمرض تصلب العظم الخبيث عند الاطفال الذي يعتبر من اشد انواع هذا المرض خطورة واسوؤها من الناحية التشخصية. في منتصف العام تم إجراء اختبار التسلسل الكامل للإكسوم (WES) على مجموعة من العائلات الفلسطينية المصابة، اظهرت نتيجة الفحص عن وجود متغيرينc.365T>A و c.108C>T في جينOSTM1 لدى المصابين. وجد لاحقا ان هذين المتغيرين لم يتم تصنيفهما من قبل باعتبارهما مسبّبين للمرض. ولذلك، تهدف الدراسة إلى تحديد مدى إسهامهما في الإصابة بمرض التصلب العظمي. المنهجية: من أجل تقييم القدرة الإمراضية لهذين المتغيرين الجينيين، تم استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي من كل فرد من أفراد العائلة المشاركة. ومن ثم تم الحصول على الحمض النووي من الدم المحيطي باستخدام ,MagLEAD 12Gc وهي أداة تستخدم لاستخلاص الحمض النووي التى تعمل بشكل آلي بالكامل، بينما تم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مادة التريزول TRIZOL الجاهزة للاستخدام وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. في بادء الامر تم إجراء تحليل للمتغيراين المعنيين على عينات الحمض النووي المعزولة من المتطوعين المصابين وعائلاتهم الممتدة بواسطت ,Sanger sequencing وذلك باستخدام primers محيطة بمواقع المتغيرات. أما بالنسبة للمتغير c.108 C>T، الذي يُفترض أنه سيسبب بانشاء RNA معطوب، فقد أُجري تحليل للحمض النووي الريبي ال RNA باستخدام Primers تحيط بالإكسونين الأول والثاني لتحديد ما إذا كان ينتج عن هذا المتغير بروتين غير طبيعي نتيجة لتغير النيوكليوتيدي الذي من المتوقع حدوثه في جين .OSTM1 النتائج: من خلال تحليل طريقة وراثة المتغيرين لدى 36 مشاركًا في البحث باستخدام Sanger sequencing تم الحصول على النتائج التالية: أن الأفراد غير المصابين بالمرض كلا المتغيرين تم توريثهما معا اما في حالة Heterozygous اوWild-Type ، في حين أن الأفراد المصابين بتصلب العظم حدث تغير نيوكليوتيدي بشكل كامل في كلا المتغيرين .(Homozygous) كما وأشار تحليل Electropherograms إلى وجود نمط وراثي متنحٍ كما هو معروف سابقا وان كلا المتغيرين مقترنان وينتقلان معا على نفس الاليل. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تحليل الحمض النووي الريبي (RNA) للمتغيرc.108 C>T في جينOSTM1 . وأظهر التحليل أنه خلافًا للاعتقاد السابق، فإن الطفرة لم تنشئ موقعًا جديدا للربط على مستوى الRNA (New Splicing-Site). الخاتمة: لقد أتاحت هذه الدراسة فرصة للكشف عن المتغير الجيني المسؤول عن المرض في العائلات المشمولة. يمكن أن تساعد هذه المعرفة في تحديد الأشخاص المعرضين للخطر وتوفير العلاج الوقائي، بالإضافة إلى تحسين المشورة للمرضى وزيادة الوعي حول أهمية الفحص قبل الزواج للكشف عن المتغير المسبب للمرض في جين OSTM1. يمكن أن تُسهم الأبحاث المُستمرة في مساعدتنا على فهم الآثار المترتبة على هذه النتائج على الصحة بشكل عام ومساعدة عدد لا يحصى من العائلات على أن تكون أكثر استعداداً للتعامل مع مضاعفات مرض تصلب العظام.
المقدمة: داء تصلب العظام هو اضطراب وراثي نادر يتميز بزيادة كثافة العظام كما ويسبب هشاشة العظام في الوقت نفسه. تنجم معظم الاصابات عن طفرات تؤثر على العضيات المرتبطة بالعضيات الليزوزومية. يعد جين OSTM1 أحد الجينات المرتبطة بداء تصلب العظم, حدوث طفرات في هذا الجين مرتبطة بشكل وثيق بمرض تصلب العظم الخبيث عند الاطفال الذي يعتبر من اشد انواع هذا المرض خطورة واسوؤها من الناحية التشخصية. في منتصف العام تم إجراء اختبار التسلسل الكامل للإكسوم (WES) على مجموعة من العائلات الفلسطينية المصابة، اظهرت نتيجة الفحص عن وجود متغيرينc.365T>A و c.108C>T في جينOSTM1 لدى المصابين. وجد لاحقا ان هذين المتغيرين لم يتم تصنيفهما من قبل باعتبارهما مسبّبين للمرض. ولذلك، تهدف الدراسة إلى تحديد مدى إسهامهما في الإصابة بمرض التصلب العظمي. المنهجية: من أجل تقييم القدرة الإمراضية لهذين المتغيرين الجينيين، تم استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي من كل فرد من أفراد العائلة المشاركة. ومن ثم تم الحصول على الحمض النووي من الدم المحيطي باستخدام ,MagLEAD 12Gc وهي أداة تستخدم لاستخلاص الحمض النووي التى تعمل بشكل آلي بالكامل، بينما تم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مادة التريزول TRIZOL الجاهزة للاستخدام وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. في بادء الامر تم إجراء تحليل للمتغيراين المعنيين على عينات الحمض النووي المعزولة من المتطوعين المصابين وعائلاتهم الممتدة بواسطت ,Sanger sequencing وذلك باستخدام primers محيطة بمواقع المتغيرات. أما بالنسبة للمتغير c.108 C>T، الذي يُفترض أنه سيسبب بانشاء RNA معطوب، فقد أُجري تحليل للحمض النووي الريبي ال RNA باستخدام Primers تحيط بالإكسونين الأول والثاني لتحديد ما إذا كان ينتج عن هذا المتغير بروتين غير طبيعي نتيجة لتغير النيوكليوتيدي الذي من المتوقع حدوثه في جين .OSTM1 النتائج: من خلال تحليل طريقة وراثة المتغيرين لدى 36 مشاركًا في البحث باستخدام Sanger sequencing تم الحصول على النتائج التالية: أن الأفراد غير المصابين بالمرض كلا المتغيرين تم توريثهما معا اما في حالة Heterozygous اوWild-Type ، في حين أن الأفراد المصابين بتصلب العظم حدث تغير نيوكليوتيدي بشكل كامل في كلا المتغيرين .(Homozygous) كما وأشار تحليل Electropherograms إلى وجود نمط وراثي متنحٍ كما هو معروف سابقا وان كلا المتغيرين مقترنان وينتقلان معا على نفس الاليل. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تحليل الحمض النووي الريبي (RNA) للمتغيرc.108 C>T في جينOSTM1 . وأظهر التحليل أنه خلافًا للاعتقاد السابق، فإن الطفرة لم تنشئ موقعًا جديدا للربط على مستوى الRNA (New Splicing-Site). الخاتمة: لقد أتاحت هذه الدراسة فرصة للكشف عن المتغير الجيني المسؤول عن المرض في العائلات المشمولة. يمكن أن تساعد هذه المعرفة في تحديد الأشخاص المعرضين للخطر وتوفير العلاج الوقائي، بالإضافة إلى تحسين المشورة للمرضى وزيادة الوعي حول أهمية الفحص قبل الزواج للكشف عن المتغير المسبب للمرض في جين OSTM1. يمكن أن تُسهم الأبحاث المُستمرة في مساعدتنا على فهم الآثار المترتبة على هذه النتائج على الصحة بشكل عام ومساعدة عدد لا يحصى من العائلات على أن تكون أكثر استعداداً للتعامل مع مضاعفات مرض تصلب العظام.
Description
Keywords
Citation
Eid، Maram Ali. (2025). Characterization of two variants in OSTM1 gene inosteopetrosis-affected Palestinian families. [رسالة ماجستير منشورة، جامعة القدس، فلسطين]. المستودع الرقمي لجامعة القدس.